Клеточная инженерия — одно из наиболее важных направлений в биотехнологии, объектами которой являются микробы (бактерии, вирусы, протозойные организмы), а также клетки (ткани) растений, животных и человека. Воспроизведение микроорганизмов при использовании различных по составу и свойствам питательных сред (in vitro) или в условиях обитания восприимчивого организма называется культивированием. Культивирование микроорганизмов в условиях in vitro получило название промышленного культивирования, а культивирование клеток и тканей растений и животных — культивированием изолированных клеток и тканей.
При промышленном культивировании процесс микробного синтеза, как правило, является частью многостадийного производства, в результате которого получают как целевой товарный продукт биосинтеза (дрожжи, кормовой белок, незаменимые аминокислоты и др.), так и «сырой» продукт, подлежащий дальнейшей переработке (сгусток казеина и др.).
Метод культивирования изолированных эукариотических клеток и тканей в условиях in vitro используют в биотехнологии для сохранения и размножения ценных генотипов, эмбриогенезе, оздоровлении посадочного материала, а также для получения продуктов вторичного синтеза (алколойды, стеройды, гликозиды, гормоны, эфирные масла и др.).
Таким образом, клеточная биотехнология базируется на способности клеток к существованию и размножению in vitro, их тотипотентности и регенерации. Применение этих особенностей раскрыло большие возможности в решении глобальных теоретических и практических задач. В области фундаментальных наук стало осуществимым исследование таких сложных проблем, как взаимодействие клеток в тканях, клеточная дифференцировка, морфогенез, реализация тотипотентности клеток, механизмы появления раковых клеток и др.
1. Особенности технологии промышленного культивирования микроорганизмов
Для осуществления любого биотехнологического процесса необходимы:
- культура микроорганизмов;
- питательная среда;
- аппаратура для выращивания и проведения вспомогательных операций;
- средства контроля и управления процессом.
Культивирование является основной стадией технологического процесса и во многом определяет количественные и качественные характеристики производства препаратов. На стадии культивирования осуществляется накопление, как самой биомассы, так и продуктов метаболизма (жизнедеятельности) микроорганизмов. Так, при производстве бактериальных препаратов целевым продуктом является сама биомасса, в других случаях продукты, синтезируемые клеткой, — антибиотики, ферменты, аминокислоты и др. При этом синтезируемый продукт может накапливаться как внутри клеток, так и выделяться в культуральную смесь. В том случае, когда культура растет на поверхности жидкой или плотной питательной среды, потребляя содержащиеся в ней субстраты и выделяя в эту среду продукты метаболизма, способ культивирования называют поверхностным. Когда же микроорганизмы распределяются по всему объему жидкой питательной среды, культивирование называют глубинным (жидкофазным).
Культивирование микроорганизмов
... продукты обмена, т.е. условия существования микроорганизмов изменяются. Периодическую культуру обычно рассматривают как замкнутую систему, переживающую разные фазы развития. микроорганизм культивирование питательный Лаг-фаза - это фаза «привыкания» клеток ... два основных способа культивирования микроорганизмов - периодическое и непрерывное. При периодическом культивировании клетки помещают в закрытый ...
В таком случае кислород поступает к клеткам в результате интенсивной операции перемешивания. Последний способ наиболее широко применяется в настоящее время в производстве большинства препаратов по следующим причинам:
1. Позволяет получить большое количество бактериальной массы за короткое время. Так, при культивировании микроорганизмов группы кишечной палочки в условиях состояния покоя количество микробов не превышает 1-2 млрд./см-3, а при применении принудительной аэрации урожайность достигает 50-60.
2. Процесс легко управляем. С целью длительного поддержания роста и размножения микроорганизмов в процессе их культивирования дополнительно вводят углеродные и азотистые соединения, а при необходимости и другие стимуляторы роста. Данный способ также позволяет легко корректировать рН среды в процессе культивирования.
3. Процесс максимально технологичен. Технологический процесс глубинного выращивания микроорганизмов в реакторах (ферментерах) складывается из следующих этапов:
- отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними;
- приготовление посевной микробной культуры;
- приготовление и стерилизация питательных сред;
- подготовка биореактора к посеву;
- выращивание микроорганизмов в реакторе и контроль над процессом культивирования. Кроме того, он включает ряд вспомогательных операций:
- стерилизацию оборудования и коммуникаций;
- приготовление и стерилизацию пеногасителей, растворов и др.
Остановимся на каждом из этапов культивирования.
2. Отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними
Эталонные штаммы микроорганизмов хранятся и поддерживаются на заданном уровне во ВГНИКИ (Всесоюзный государственный научно-исследовательский институт клеточной инженерии) ветеринарных препаратов. Эти штаммы, в свою очередь, являются производственными, поскольку на их основе готовятся вакцины. Наряду с производственными и эталонными штаммами во ВГНИКИ хранятся контрольные штаммы, которые используют для оценки качества вакцинных препаратов. Эти штаммы должны быть генетически однородными популяциями микроорганизмов со стабильными морфологическими, специфическими и биологическими свойствами. Основными требованиями к этим штаммам являются их высокие антигенные и иммуногенные свойства.
Производственные, эталонные штаммы должны сохранять генетическую стабильность антигенных, иммуногенных и других присущих им биологических свойств на протяжении 10-20 последовательных пересевов как in vivo, так и in vitro.
Приготовление посевной микробной культуры. Обычно производственное культивирование микроорганизмов осуществляется в больших объемах. Поэтому вначале из имеющегося эталонного штамма микроорганизма, находящегося, как правило, в лиофильно высушенном состоянии в ампуле, делают посевы в небольшие емкости, например, во флаконе емкостью 100-200 см3, заполненные по 50-150 мл производственной средой. Затем из флаконов делают высевы в большие емкости (бутыли объемом 18-20 л).
Технология приготовления блюда «Борщ Сибирский»
... очищают, нарезают соломкой или ломтиком, и кладут в борщ вмести с пассерованными овощами и томатным пюре. 2. Технология приготовления Борщ сибирский: 400 г (1 шт. крупная) свеклы 200 ... которых обязательно входит свекла. По составу продуктов, способу приготовления и вкусу ассортимент борщей разнообразен. Кроме свеклы, в состав борщей входит: морковь, петрушка или сельдерей, лук, томатное пюре ...
При хорошем накоплении микроорганизмов такую культуру вносят в реактор и называют посевной (маточной) культурой. При этом нужно предварительно рассчитать необходимое количество посевной культуры для производственного культивирования микроорганизмов исходя из посевной дозы, которая обычно составляет от 1 до 10% по объему. Посевные микробные культуры также контролируются на сохранение ими типичных морфологических, культурально-биохимических, антигенных и иммуногенных свойств, а также на отсутствие в них посторонней микрофлоры (ПМФ).
Приготовление и стерилизация питательных сред. Основополагающим принципом конструирования питательных сред является их полноценность, поскольку в процессе роста микроорганизмы потребляют из окружающей питательной среды целый ряд разнообразных химических веществ, составляющих основу энергетического и конструктивного обмена в клетках. К основным компонентам, формирующим клеточное вещество, относятся: углерод, азот, кислород и водород. Содержание этих элементов в различных микроорганизмах практически постоянно.
В результате разнообразия микроорганизмов, по-разному использующих углерод и азот, одинаково пригодных (универсальных) питательных сред для роста всех без исключения микроорганизмов и клеток не существует. Их специфичность зависит от содержания в них углерода и азота. В зависимости от типов используемых азотистых соединений микроорганизмы разделяются на две группы:
1. Протеолитические, т.е. расщепляющие высокомолекулярные белковые вещества и пептиды.
2. Дезаминирующие, требующие присутствия в среде готовых аминокислот, расщепление которых сопровождается выделением аммиака.
Считается, что питательные среды должны быть сбалансированы по содержанию таких органических веществ, как аминокислоты, витамины, жирные кислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, гормоны и др., добавление которых в очень незначительных количествах стимулирует рост и размножение микроорганизмов. Очень часто микроорганизмы и клетки нуждаются во многих природных аминокислотах, которые являются универсальными компонентами питания. Они целиком включаются в структуру клетки. Из всех незаменимых аминокислот ключевая роль принадлежит глютамину и аргинину, которые имеют принципиальное значение для обезврежива